Q1. 細胞如何貼壁或者固定好？

這是第一步，也是基礎和關(guān)鍵的一步，這是基礎，基礎不好，后面一切都是白搭。

對于貼壁細胞: 先將潔凈的爬片片在 70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無(wú)菌的鑷子放置到培養皿中，用無(wú)菌 PBS 洗去殘留的乙醇。待細胞接近長(cháng)成單層后取出蓋玻片(一般都是過(guò)夜培養)操作小心，防止細胞脫片。

對于懸浮細胞: 如果能像貼壁細胞一樣，那就好了。傳統這是一個(gè)痛點(diǎn)待解決，其實(shí)新的方法就是使用靶點(diǎn)科技（Biotarget）的懸浮細胞免疫熒光專(zhuān)用玻片。讓?xiě)腋〖毎?jiǎn)單四步，就能像貼壁細胞一樣固定好，主要是，細胞還是活的，還可以刺激。

Q2. 如何避免多種染色互串？

*細胞不能鋪的太密，細胞稀釋一下，濃度不能太高，盡可能用大體積來(lái)鋪細胞。太密就導致一抗結合蛋白增多，更容易出現非特異性染色，且細胞太密，顯微鏡拍照出來(lái)的效果就會(huì )很一般，一般6孔板滿(mǎn)孔的貼壁細胞，取1/8的量鋪到帶有爬片的12孔板里，大概12小時(shí)后，細胞密度就剛剛好。懸浮細胞，直接用靶點(diǎn)科技的懸浮細胞免疫熒光專(zhuān)用玻片就行。雙抗體染色時(shí)可不用活細胞染核液（Hoechst），也就是不要最開(kāi)始染核，放到最后封片時(shí)，用DAPI染，DAPI濃度不要過(guò)高，核很容易被染色，低濃度染色即可。

*支原體清除后再做IF。用狀態(tài)好，未被污染的細胞去做IF，狀態(tài)好的細胞伸展很開(kāi)，染色效果也更好，若細胞支原體污染，可能會(huì )產(chǎn)生背景臟，圖像不完整等現象，非特異性染色嚴重且去不掉，染核染抗體都會(huì )被染上亂七八糟的東西。

*一抗濃度的問(wèn)題。雙抗體染色若外轉質(zhì)粒，可染標簽抗體，標簽抗體更特異且使用濃度低，一般都在1：500左右；若染內源性蛋白，濃度可1：200，做之前記得看下抗體說(shuō)明書(shū)該抗體是否可以做IF；4度過(guò)夜染效果更好，一抗可回收，負20保存，大概可用3次，根據抗體靈敏度決定使用次數；雙抗體IF，一定要用不同來(lái)源的的抗體，一個(gè)用鼠，一個(gè)用兔，最好不要雙鼠或者雙兔的。

*二抗：常溫孵育1～2h，避光，避開(kāi)同屬性的二抗，洗滌一抗可用pbs，洗滌二抗可以用tbst，多加一些吐溫。吐溫可以洗滌掉非特異結合的抗體，多洗幾次。

*拍攝：封片后拍攝時(shí)，可以適當縮短激發(fā)光波長(cháng)，使其沒(méi)有交叉波長(cháng)。比較好的選擇：綠光488，紅光555。重合的波譜，就會(huì )不單純激發(fā)。拍出來(lái)就不單純。