實(shí)體瘤不僅由惡性細胞組成，而且是復雜的器官樣結構，包含多種細胞類(lèi)型，包括多種遷移性造血細胞和常駐基質(zhì)細胞。白細胞浸潤到實(shí)體瘤中的作用在十多年前就被注意到了。這些細胞類(lèi)型遷移到腫瘤中被解釋為宿主對生長(cháng)中的腫瘤產(chǎn)生免疫反應的證據，但最近很明顯，腫瘤在很大程度上被認為是自身并且缺乏強抗原。相反，它們似乎被選中來(lái)操縱宿主免疫系統以防止排斥反應并利用它來(lái)促進(jìn)自己的生長(cháng)和傳播。這導致提出由骨髓細胞、中性粒細胞、樹(shù)突狀細胞 （DC）、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞和巨噬細胞組成的造血細胞浸潤在致癌作用中起因果作用。從廣泛的實(shí)體瘤中收集的臨床數據強調了這些發(fā)現，因為高密度的白細胞浸潤，尤其是巨噬細胞，與疾病的不良預后相關(guān)。

腫瘤相關(guān)巨噬細胞 （TAM） 產(chǎn)生大量促進(jìn)腫瘤發(fā)生的因子。突出的包括堿性成纖維細胞生長(cháng)因子 （bFGF）、血管內皮生長(cháng)因子 （VEGF）、血小板衍生生長(cháng)因子 （PDGF）、轉化生長(cháng)因子 β （TGFβ）、血管生成素（Ang1 和 Ang2）、IL-1 和 IL-8 等白細胞介素、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、胸苷磷酸化酶 （TP）、基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-9 和 MMP-2、一氧化氮 （NO） 和趨化因子 。這些分子的協(xié)調空間和時(shí)間表達導致內皮細胞 （EC） 的增殖和遷移、細胞外基質(zhì)的重塑和穩定血管的形成。巨噬細胞容易促進(jìn)這些過(guò)程，因為它們的單核細胞前體遷移到特定位置，例如缺氧腫瘤組織，在那里他們分化和合成血管生成分子。腫瘤需要血管生成才能長(cháng)出超過(guò)幾毫米的大小。血管生成還被發(fā)現通過(guò)提供氧氣和營(yíng)養以及清除廢物對廣泛的腫瘤生長(cháng)和轉移至關(guān)重要。VEGF 生長(cháng)因子家族由結構高度相關(guān)的蛋白質(zhì)及其相應的受體組成，在血液系統惡性腫瘤和實(shí)體瘤的血管生成過(guò)程中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。幾種靶向 VEGF 或其受體的治療方法顯示出良好的臨床結果。此外，最近的研究表明，由募集骨髓衍生的血管白細胞介導的血管發(fā)生，這些血管白細胞同時(shí)表達內皮細胞和樹(shù)突狀細胞標志物并分化為內皮樣細胞，在腫瘤血管生成中起著(zhù)重要作用。Maruyama 等人新近發(fā)表的一篇論文記錄了巨噬細胞在病理性淋巴管生成中起的關(guān)鍵作用，他們提供了證據，證明 CD11b+ 巨噬細胞能夠轉分化為淋巴內皮細胞簇，這些細胞簇在小鼠角膜移植模型中加入現有的淋巴管。

雙膦酸鹽是臨床上用于預防或抑制骨轉移或骨過(guò)度吸收發(fā)展以及治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節炎和骨關(guān)節炎等炎癥性疾病的化合物。最近，已發(fā)現使用雙膦酸鹽作為抗血管生成劑可以抑制實(shí)體瘤的生長(cháng)和轉移（Giraudo 等人，2004 年）。隨著(zhù)雙膦酸鹽氯膦酸鹽包埋到脂質(zhì)體 （Clodronate Liposoems，Nico Van Rooijen等人） 中，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種用于選擇性耗竭巨噬細胞的有效試劑，并成功應用于多項免疫學(xué)研究。因此，我們研究了 TAMs 耗竭是否會(huì )抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長(cháng)和播散的可能性。在這里，我們表明氯膦酸鹽脂質(zhì)體介導的 TAM 耗竭抑制腫瘤生長(cháng)，可能是通過(guò)阻斷腫瘤血管生成。

體外實(shí)驗

游離氯膦酸鹽：clodronate

脂質(zhì)體包裹的氯膦酸：liposome encapsulated clodronate (clodrolip)，Clodronate Liposomes

in vitro effect of free and liposome encapsulated clodronate (clodrolip). (A) Concentration-dependent cytotoxicity of clodrolip on macrophages (isolated from Sv129 mice by peritoneal lavage) in vitro. (B) Cytotoxicity of clodronate or clodrolip on different cells in vitro. Macrophages, HUVE, F9 and A673 cells were cultured in the presence of 1?mg?ml?1 clodronate or clodrolip for 6?h. Results are means±s.e.m. (n=3). Statistical analysis: *P<0.05 vs untreated cells.

體內實(shí)驗

in vivo effect of free and liposome encapsulated clodronate (clodrolip)。(C) Selective depletion of spleen cell populations after treatment with clodronate and clodrolip. Spleen tissues obtained from immunocompetent Sv129 mice injected with PB, clodronate or with clodrolip are shown (initial dose 2?mg?20?g?1 mouse body weight, followed by 1?mg, every 4 days, i.p.). Spleens were removed and sections IHC stained for marginal zone metallophilic MOMA1+, marginal zone ER-TR 9+, red pulp F4/80+, CD68+ and CD11b+ macrophages, the DC subsets FDC+ and CD11c+, B220+ B cells, and CD3+ T cells. Bar: 100?μm.

顯而易見(jiàn)，Cloddrolip組清除巨噬細胞效果更優(yōu)，如上圖所示，F4/80陽(yáng)性的巨噬細胞相比較對照組PBS和游離氯膦酸鹽組，簡(jiǎn)直碾壓。同時(shí)也證明了游離氯膦酸鹽無(wú)法體內清除巨噬細胞。因此，建議訂購荷蘭Liposoma商業(yè)化巨噬細胞清除劑--Clodronate Liposomes,氯膦酸鹽脂質(zhì)體。貨號CP-005-005. 同時(shí)，相比較對照組PBS，氯膦酸鹽脂質(zhì)體對其他免疫細胞沒(méi)有清除效果?？梢钥次覀冎暗奈恼?，巨噬細胞清除劑會(huì )清除外周血其他細胞嗎？巨噬細胞清除劑會(huì )清除骨髓其他細胞嗎？

Clodrolip（Clodronate Liposomes） promotes macrophage depletion and inhibits tumour growth

We next studied the effects of clodrolip on tumour progression and angiogenesis in the highly vascularised and fast-growing syngeneic F9 teratocarcinoma mouse tumour model. Mice were treated i.p. with PB, empty liposomes, clodronate or clodrolip. The initial clodronate dose was 2?mg?20?g?1 mouse body weight, followed by 1?mg?20?g?1 mouse body weight given every 4 days. Therapy onset was 6?h after tumour cell inoculation. In two groups, clodrolip therapy was delayed to days 4 and 8, respectively. Clodrolip treatment inhibited tumour growth, even at the most delayed therapy onset (days 8 and 12) (Figure 2A and Supplementary Figure s2A). The most effective growth inhibition (74%, P=0.0185) was obtained with an early treatment on days 0, 4, 8 and 12. Clodronate (5?mg) given on days 0, 4, 8, 12 had an insignificant inhibitory effect of 45% (P=0.21), comparable to the days 4, 8 and 12 delayed clodrolip schedule (49%, P=0.167). The delayed onset of therapy at time points where tumours were already established and well vascularised (day 4 or 8) resulted in less pronounced growth inhibition, suggesting that macrophage depletion in large tumours is not sufficient to efficiently inhibit tumour growth.

荷蘭Nico Van Rooijen教授First開(kāi)發(fā)了該試劑，也就是現在的荷蘭Liposoma品牌，國內客戶(hù)可以直接訂購巨噬細胞清除劑：氯膦酸鹽脂質(zhì)體Clodronate Liposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體，訂購貨號CP-005-005。規格是5ml清除劑+5ml對照試劑。國內客戶(hù)可以聯(lián)系大中華辦事處靶點(diǎn)科技（Target Technology）。專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團隊給您的巨噬細胞清除實(shí)驗以解決方案，以及根據結果給與優(yōu)化和建議。