哺乳動(dòng)物細胞組織培養技術(shù)指南。涵蓋大量關(guān)于哺乳動(dòng)物細胞系的維持、分裂和細胞保存的信息。請注意，所有細胞培養必須使用無(wú)菌技術(shù)在層流罩中進(jìn)行。

細胞培養是細胞和分子生物學(xué)中使用的關(guān)鍵工具，可以對細胞的生理學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行建模。此外，細胞培養使研究人員能夠確定藥物和有毒化合物對細胞反應的影響。由于使用一批克隆細胞可獲得一致和可重復的結果，細胞培養仍然是當今研究中使用*泛的技術(shù)之一。

來(lái)自動(dòng)物或植物的細胞在有利環(huán)境中的生長(cháng)被稱(chēng)為細胞培養。不同的細胞有不同的培養要求，為了達到最佳的生長(cháng)效果，可以通過(guò)培養基的選擇和補充劑來(lái)滿(mǎn)足。所用介質(zhì)的作用是提供必需的營(yíng)養物質(zhì)（氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)）、生長(cháng)因子、激素、氣體（O2、 CO2），并調節物理化學(xué)環(huán)境（pH值、滲透壓、溫度）。

原代培養是指在組織分離后直接進(jìn)行培養的細胞。一旦這些細胞匯合，即會(huì )占據燒瓶中所有可用空間，此時(shí)就需要將它們轉移到一個(gè)新的生長(cháng)容器中進(jìn)行傳代或分割，這將為細胞提供更多的繼續生長(cháng)和擴展的空間。第一次傳代后，原代培養現在成為所謂的細胞系。源自原代培養的細胞系壽命有限，這意味著(zhù)它們在衰老之前只能分裂有限的次數。

由于細胞被傳代，生長(cháng)能力*的細胞占優(yōu)勢，導致群體的基因型和表型一致。永生細胞系廣泛用于細胞和分子生物學(xué)，以繞過(guò)衰老等問(wèn)題。細胞可以通過(guò)多種不同方式轉化并永生。自發(fā)地、化學(xué)地或病毒地。一旦轉化，這些細胞就獲得了無(wú)限分裂的能力，成為一個(gè)連續的細胞系。

細胞系可以是：

1.貼壁（貼壁依賴(lài)性）——貼壁細胞必須在附著(zhù)于固體或半固體底物上時(shí)進(jìn)行培養，通常需要胰蛋白酶法進(jìn)行亞培養（更多信息請參見(jiàn)2.6）。

2.懸?。ㄅc錨固無(wú)關(guān)）——懸浮細胞不需要固體生長(cháng)底物，可以懸浮在培養基中生長(cháng)。

以下是細胞系培養的通用指南。所有細胞培養必須在微生物安全柜中進(jìn)行，使用無(wú)菌技術(shù)確保無(wú)菌。研究人員必須全程穿著(zhù)防護服。

良好的無(wú)菌技術(shù)旨在創(chuàng )建無(wú)菌環(huán)境，并充當微生物與無(wú)菌細胞培養罩之間的屏障。該技術(shù)的關(guān)鍵包括使用無(wú)菌試劑和培養基。無(wú)菌操作確保未經(jīng)過(guò)70%乙醇噴灑過(guò)的任何物體進(jìn)入罩內。

層流罩制備

細胞培養罩可提供無(wú)菌工作區，同時(shí)可確?？刂莆⑸锍绦虍a(chǎn)生的任何傳染性飛濺物或氣溶膠。細胞培養罩有3種類(lèi)型，分別為I級、II級和III級，這些都是為了滿(mǎn)足不同的研究和生物安全需求而開(kāi)發(fā)的。請根據實(shí)驗需求選擇合適的產(chǎn)品。

使用層流罩

在開(kāi)始之前，確保針對感目標細胞系使用正確的培養基類(lèi)型和培養補充劑。這些必須始終是無(wú)菌的，并且只能在罩內打開(kāi)。大多數細胞系可以使用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養基或含10％胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培養基。如果需要，可以添加2mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何準備DMEM介質(zhì)

某些內皮細胞系需要特殊的膠原蛋白基質(zhì)才能生長(cháng)。這些基質(zhì)確保細胞系的附著(zhù)、分化和生長(cháng)。在開(kāi)始細胞培養實(shí)驗之前，重要的是對目標胞系進(jìn)行文獻調查，以確保滿(mǎn)足任何額外的生長(cháng)要求，如基質(zhì)。請注意所用燒瓶的類(lèi)型，即通氣或不通氣。如果使用非通氣/塞瓶燒瓶，請確保松開(kāi)蓋子以進(jìn)行氣體交換。如果使用通氣燒瓶，請確保過(guò)濾器不會(huì )弄濕，因為這會(huì )影響氣體交換的效率。

如何為內皮和上皮細胞制備1％明膠基質(zhì)

每天應在顯微鏡下檢查細胞，以確保它們健康并按預期生長(cháng)。熟悉顯微鏡下健康細胞的外觀(guān)非常重要，因為這將使通過(guò)形態(tài)變化檢測靜止或感染的細胞更加容易。

如果出現以下情況，請丟棄細胞：

哺乳動(dòng)物細胞匯合時(shí)應分裂/傳代，這在燒瓶中70-80％的面積被細胞覆蓋時(shí)發(fā)生。在貼壁細胞中，當沒(méi)有可見(jiàn)的空間可用于細胞生長(cháng)時(shí)，可以在顯微鏡下觀(guān)察到匯合。對于懸浮細胞，當細胞凝聚在一起時(shí)，可以注意到匯合，并且當燒瓶旋轉時(shí)，培養基看起來(lái)會(huì )混濁。

重要的是，不要讓細胞過(guò)度匯合，以70-80％的匯合為最佳量，在這種情況下，接觸抑制作用開(kāi)始生效，并且細胞在重新接種后需要更長(cháng)的恢復時(shí)間。細胞系生長(cháng)的速度將決定所使用的分裂比。例如，如果以高比例分裂，生長(cháng)緩慢的細胞系將不能很好地發(fā)揮作用。

快速生長(cháng)的細胞系可能需要較高的分裂比例，因為與生長(cháng)較慢的細胞系相比，它們需要更短的時(shí)間達到匯合。通常，細胞分裂的比例不應超過(guò)1:10，因為這對于細胞而言太低，將是細胞無(wú)法生存。改變培養物的接種密度可確保細胞在特定的一天準備好進(jìn)行實(shí)驗。

作為通用指南，一個(gè)匯合燒瓶中的細胞：70-80％的匯合分裂比例應為1：2，并準備在1-2天進(jìn)行實(shí)驗。70-80％的匯合分裂比例應為1：5，并準備在2-4天進(jìn)行實(shí)驗。70-80％的匯合分裂比例應為1：10，并準備在4-6天進(jìn)行亞培養或電鍍。但這可能取決于細胞系的生長(cháng)速率。

* 胰蛋白酶消化可能對有些細胞有毒。它還可以誘導某些膜蛋白的暫時(shí)內在化，在設計實(shí)驗時(shí)應予以考慮。在這些情況下，通?？梢允褂闷渌椒ǎɡ鐪睾偷募毎尾粱蚴褂们鍧崉┐?。

如果細胞已經(jīng)生長(cháng)了幾天，但匯合程度不足以分裂，則必須更換介質(zhì)以補充營(yíng)養并保持pH值。

對于貼壁細胞

對于懸浮細胞

傳代數是細胞經(jīng)歷的傳代培養的次數。應記錄傳代數并且傳代數不應太高。與低傳代細胞相比，傳代數大于30的細胞系更有可能獲得遺傳異常（Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006）。

P30通常被認為是培養中某些細胞傳代的上限，因為進(jìn)一步培養可能會(huì )導致分子譜的顯著(zhù)變化，限制其在體內的應用和可重復性（Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004）。

冷凍細胞系是細胞培養的重要組成部分，因為更換細胞系既昂貴又費時(shí)，而且還可以確保如果細胞被感染，還將擁有備用庫存并可以重新開(kāi)始。一旦有多余的細胞可用，最好是低傳代數以限制遺傳漂變，就應將其冷凍為接種庫存。然后可以從接種庫存中準備使用的細胞。

冷凍保存細胞的最佳和*泛使用的方法是將它們保存在帶有冷凍保護劑，例如二甲基亞砜（DMSO）的液氮中。冷凍保護劑（例如DMSO）降低了培養基的凝固點(diǎn)并降低了冷卻速度，從而大大降低了冰晶形成的風(fēng)險，而該冰晶會(huì )導致細胞死亡和損壞。配置細胞凍存液需要培養基，血清和DMSO，按照一定比例配置。費事費時(shí)費力。靶點(diǎn)科技有現成直接使用的Bambanker無(wú)血清細胞凍存液（貨號BB01），可以直接放到-80，無(wú)需梯度程序降溫。

冷凍細胞方案

*以盡可能高的濃度和盡可能低的傳代數冷凍培養的細胞。冷凍之前，請確保至少有90％的細胞能夠存活。始終使用無(wú)菌冷凍管保存冷凍細胞。始終使用適當的無(wú)菌技術(shù)，并在層流罩中工作。

安全注意事項：使用DMSO時(shí)應格外小心，因其會(huì )促進(jìn)有機分子進(jìn)入組織。處理該試劑時(shí)，請戴手套并穿著(zhù)適當的防護服。按照當地法規處理試劑。

解凍細胞對冷凍細胞的壓力*，因此與冷凍細胞應緩慢進(jìn)行冷凍不同，解凍細胞應盡可能快地進(jìn)行，以確保細胞的高存活率。

解凍細胞方案

細胞培養實(shí)驗室中最常見(jiàn)的污染物之一是支原體。支原體是一種缺乏細胞壁的基本細菌，被認為是最小的自我復制生物。由于支原體的尺寸很?。ù蠹s> 1µm），因此很難檢測到，直到達到*的密度并導致細胞培養物變質(zhì)才會(huì )知道它們的存在。

許多生長(cháng)緩慢的支原體可以在未檢測到的培養物中持續存在而不會(huì )引起細胞死亡，但是，它們可以改變培養物中宿主細胞的行為和代謝。慢性支原體感染也可能導致懸浮培養物中細胞增殖速率降低，飽和密度降低和凝集。檢測此類(lèi)支原體感染的方法是定期檢測細胞培養物；熒光染色（例如Hoechst）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定。

應謹慎使用細胞培養中的抗生素。連續使用抗生素會(huì )增強抗生素耐藥性，允許存在低水平的污染并掩蓋各種污染物。一些抗生素還可以與細胞發(fā)生交叉反應并干擾正在研究的細胞過(guò)程。

細胞培養實(shí)驗室根據研究機構和研究領(lǐng)域的不同而有很大差異。但是，所有細胞培養實(shí)驗室確實(shí)都具有一些的通用設備和要求，其中最重要的是保持無(wú)菌的病原體環(huán)境。以下是可在更多細胞培養實(shí)驗室中使用的常見(jiàn)設備和材料的列表。此列表并不完整，根據研究領(lǐng)域的不同可見(jiàn)其中的偏差。

基本設備

細胞培養實(shí)驗室根據研究機構和研究領(lǐng)域的不同而有很大差異。但是，所有細胞培養實(shí)驗室確實(shí)都具有一些的通用設備和要求，其中最重要的是保持無(wú)菌的病原體環(huán)境。以下是可在更多細胞培養實(shí)驗室中使用的常見(jiàn)設備和材料的列表。此列表并不完整，根據研究領(lǐng)域的不同可見(jiàn)其中的偏差。

• 細胞培養罩（即層流罩或生物安全柜）
• 保溫箱（建議使用潮濕的CO2保溫箱）
• 水浴
• 離心機
• 冰箱和冰柜（–20℃）
• 細胞計數器（自動(dòng)細胞計數器或血細胞計數器）
• 倒置顯微鏡
• 液氮（N2）冰箱或冷凍儲藏容器
• 細胞培養容器（例如燒瓶、培養皿、滾瓶、多孔板）
• 移液器
• 注射器和針頭
• 垃圾箱
• 培養基、血清和試劑
• 細胞